蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者是斯坦福大學(xué)George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中被稱(chēng)為Western Blot。最開(kāi)始做印跡的是一個(gè)叫Southern的科學(xué)家，但印跡的對(duì)象是DNA鏈，他把這種技術(shù)稱(chēng)為Southern blot，后來(lái)出現(xiàn)了兩個(gè)過(guò)程相似，但是對(duì)象不同的印跡方法，一個(gè)針對(duì)RNA，一個(gè)對(duì)蛋白質(zhì)，人們分別把這兩種技術(shù)的稱(chēng)為Northern和Western，與這兩個(gè)技術(shù)的發(fā)明人沒(méi)有關(guān)系了。

一、蛋白質(zhì)的樣品制備：

由于這一步方法各異，具體步驟請(qǐng)參考試劑盒的說(shuō)明書(shū)即可。蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的第一步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問(wèn)題:

> 在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。

> 選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵，使其形成一個(gè)各自多肽的溶液。盡量去除核酸，多糖，脂類(lèi)等干擾分子。

> 防止蛋白質(zhì)在樣品處理過(guò)程中的人為的修飾，制備過(guò)程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類(lèi)的修飾（加入合適的蛋白酶抑制劑）。

> 樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出20ul檢測(cè)蛋白質(zhì)定量用），然后保存與-20°或-80℃中長(zhǎng)期保存，但要注意不要反復(fù)凍融，因?yàn)闀?huì)使蛋白的抗原特性發(fā)生改變。

> 若蛋白提取過(guò)程存在問(wèn)題或蛋白發(fā)生降解則很難進(jìn)行好之后的實(shí)驗(yàn)，也就很難做出好的結(jié)果了。除此之外 loading buffer的作用也不容忽視，切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時(shí)在處理時(shí)也應(yīng)注意將樣品與loading buffer混合均勻。

二、蛋白質(zhì)定量

如果要定量的話，一般選擇BCA或者Bradford方法，BCA要求檢測(cè)波長(zhǎng)為562nm，Bradford為595nm。具體方法見(jiàn)各試劑盒說(shuō)明書(shū)。為避免假陽(yáng)性結(jié)果，建議先把lysis buffer加入BCA工作液或考馬G250混合看是否產(chǎn)生顏色。測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含50~100ug蛋白的溶液體積即為上樣量（一般8cm寬的迷你膠每個(gè)泳道最大能承載的蛋白質(zhì)量為150ug，所以如果從組織提取蛋白的話上樣量不宜過(guò)大）。

網(wǎng)上有人喜歡等質(zhì)量上樣（即每個(gè)泳道的上樣體積不一但質(zhì)量一定），也有使用等體積上樣（即先把各個(gè)樣品稀釋到某一固定濃度，然后等體積等質(zhì)量上樣，計(jì)算上樣體積時(shí)需包含loading buffer的體積）。按分子克隆的說(shuō)法，還是使用等體積上樣比較好。

上樣總體積一般不超過(guò)15ul，加樣孔的最大限度可加20ul樣品。上樣前要將樣品置于燒杯內(nèi)，將燒杯置于石棉網(wǎng)上用酒精燈加熱至沸騰，在沸水中煮3~5min使蛋白充分變性。也可以使用PCR儀95°加熱5min，效果佳，操作方便。之后樣品可以在4℃冰箱短時(shí)間保存，也可在-20°冰箱保存數(shù)月，但是反復(fù)凍融會(huì)使蛋白質(zhì)的抗原特性改變。

三、SDS－PAGE電泳

1. 清洗玻璃板：

蘸點(diǎn)洗潔精輕輕擦洗。兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。若不繼續(xù)使用，需用無(wú)水乙醇擦拭后晾干再妥善收起來(lái)，玻璃板之間墊玻璃紙隔開(kāi)。梳子應(yīng)用水洗干凈，臨用前用無(wú)水乙醇擦拭晾干。

2. 灌膠與上樣

① 玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠（操作前先往玻璃板間灌水，檢查是否漏）。

② 按配膠試劑盒說(shuō)明書(shū)選擇合適的分離膠濃度配置，最后加入TEMED，之后搖勻即可灌膠。配制凝膠時(shí)要充分混勻，此外應(yīng)保證試劑的新鮮，特別是過(guò)硫酸銨。灌膠時(shí)掌握好速度，避免氣泡產(chǎn)生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快（灌膠時(shí)開(kāi)始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。

操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變形）。未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)應(yīng)該戴手套防護(hù)。梳子插入濃縮膠時(shí)，應(yīng)確保沒(méi)有氣泡。注意給積層膠留出足夠的空間（分子克隆推薦長(zhǎng)度為插入的梳齒長(zhǎng)再加1cm）。

③ 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了。再等幾分鐘覺(jué)得差不多的時(shí)候就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。聚合時(shí)間由AP以及TEMED決定，通常在30min左右，AP不新鮮會(huì)導(dǎo)致聚合變慢，氣溫較低時(shí)膠是會(huì)凝得慢一些，必要時(shí)可適當(dāng)增加AP以及TEMED的量，但通常不會(huì)超過(guò)1h，若超過(guò)1h甚至更長(zhǎng)仍未聚合，應(yīng)檢查配制的操作有無(wú)錯(cuò)誤。由于TEMED催化APS釋放相關(guān)化學(xué)基團(tuán)，再由APS釋放的基團(tuán)催化Acr/Bis聚合，所以如果APS不新鮮的話加再多的TEMED效果也不佳，這就是為什么推薦APS每周新鮮配置的原因。

④ 按說(shuō)明書(shū)配積層膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固前最好在兩邊補(bǔ)膠至剛剛冒頂。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。

⑤ 趁積層膠聚合的這段時(shí)間，取適當(dāng)體積樣本混合1X SDS loading buffer（最好事前分裝好，每次從冰箱里取一管即可），95~100°加熱5min，若有沉淀可用稍低溫度，比如45~55°加熱1h達(dá)到變性的目的。我一般習(xí)慣分裝20ul到PCR管里，先和loading buffer混合好，臨用前用PCR儀加熱95°C 5min，效果不錯(cuò)。

⑥ 膠做好后連同玻璃板一起安裝到電泳槽上，加入電泳緩沖液后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣（我們使用的是大連競(jìng)邁科技公司的MV-III型小型單垂直板電泳槽，電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板，電泳槽下面不用倒太多電泳液）。加樣前可用5ml注射器或加樣器先沖洗一下加樣孔。用微量加樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。

加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。目前我們做的mini膠上有10個(gè)上樣孔，一般在第一個(gè)孔加入marker（我用的是Fermentas預(yù)染marker），其余9個(gè)孔加入樣品，也可在頭尾孔內(nèi)加入marker，中間8個(gè)孔加樣品。加樣前樣品應(yīng)先離心，尤其是長(zhǎng)時(shí)間放置的樣品。在未加樣的孔中應(yīng)加入等量的樣品緩沖液。上樣時(shí)，小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。也可使用10ul的槍頭就行，比用微量加樣器快很多，用槍頭時(shí)注意不要插得太深，容易把玻璃板撐開(kāi)，樣品就落到膠和玻璃板之間的空隙了。

3. 電泳

電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺，網(wǎng)上有資料建議低電壓短時(shí)間的預(yù)電泳，清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠孔徑以保證電泳過(guò)程中電泳的暢通，但是在《分子克隆》上卻反對(duì)這種做法，理由是會(huì)破壞緩沖系統(tǒng)pH的不連續(xù)性。請(qǐng)各位按照實(shí)際經(jīng)驗(yàn)來(lái)做即可。電泳時(shí)間和電壓說(shuō)法各異。按照各實(shí)驗(yàn)室的慣例或者電泳槽的使用說(shuō)明來(lái)操作。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。為減少蛋白質(zhì)條帶的擴(kuò)散，上樣后應(yīng)盡快進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后也應(yīng)直接或者轉(zhuǎn)印